【前沿背景】
大多數(shù)接觸活性物質(zhì)在水中的溶脹度不高。但是，許多生物材料應(yīng)用都需要使用水凝膠。后者具有獨(dú)特的特質(zhì)，例如減震，低滑動分?jǐn)?shù)和對刺激敏感的腫脹/溶脹，因此在醫(yī)學(xué)等多個領(lǐng)域都很重要，例如組織工程，衛(wèi)生應(yīng)用，人造軟骨，軟骨再生，植入進(jìn)入皮下組織，角膜修復(fù)材料，傷口和手術(shù)密封劑，藥物遞送庫，傷口護(hù)理材料，人造肌肉和組織修復(fù)。在Ng等人(DOI: 10.1016/j.addr.2014.10.028)和Malmsten (DOI: 10.1039/c1sm05809f)的評論中討論了抗微生物活性水凝膠的重要性。
已知?dú)⑺榔浔砻嫔系奈⑸锏?a href="/kx/keji/61827.html">水凝膠的幾個例子。Liu等人(DOI: 10.1002/adma.201202225)發(fā)表了一種原位形成的抗菌和防污水凝膠，該凝膠可以應(yīng)用在植入物（如導(dǎo)管）上作為涂層，由含有季銨基團(tuán)的聚碳酸酯和聚乙二醇制成，該涂層在14天內(nèi)有效，并且沒有抑制作用瓊脂平板測定中的區(qū)域。Salick等人(DOI: 10.1002/adma.200900189)設(shè)計(jì)了β-發(fā)夾肽水凝膠。可以抑制清潔表面上的潛在感染，也可以將其運(yùn)送到受感染的位置，在此處細(xì)菌細(xì)胞可以被殺死。Giano等人(DOI: 10.1038/ncomms5095)通過混合聚葡聚糖醛和支鏈聚乙烯亞胺溶液，報(bào)道了一種固有的，可注射器注射的，生物相容性的抗菌水凝膠。這種用于傷口填充的粘合劑可節(jié)省人類紅細(xì)胞并殺死革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌。在所有情況下，抗菌基團(tuán)都是凝膠功能結(jié)構(gòu)的一部分，并定義了其特性。
【科研摘要】
早前，多特蒙德工業(yè)大學(xué)Joerg C. Tiller教授團(tuán)隊(duì)通過反式1,4-二溴-2-丁烯與N，N，N'，N'-四甲基-1,3-丙二胺的加聚反應(yīng)得到的血液相容性抗菌3,4-en-紫羅烯（PBI）通過它的溴端基使用三（2-氨基乙基）胺（TREN）形成快速膨脹的抗菌超吸水劑。相關(guān)論文Cross-Linking of a Hydrophilic, Antimicrobial Polycation toward a Fast-Swelling, Antimicrobial Superabsorber and Interpenetrating Hydrogel Networks with Long Lasting Antimicrobial Properties發(fā)表在《ACS Applied Materials & Interfaces》上。這種超級吸水劑在60 s內(nèi)承擔(dān)了其重量的30倍，而粒狀材料承擔(dān)了其重量的96倍，形成了水凝膠。它完全可以防止金黃色葡萄球菌的生長。用丙烯酸2-羥乙酯和二甲基丙烯酸甘油酯溶脹PBI網(wǎng)絡(luò)，然后光聚合以形成互穿的水凝膠（IPH），PBI含量在2.0至7.8重量％的范圍內(nèi)變化。其中一種負(fù)責(zé)材料性能的聚合物網(wǎng)孔，另一種負(fù)責(zé)抗菌性能的聚合物網(wǎng)孔。通過原子力顯微鏡和透射電子顯微鏡確認(rèn)了IPH的納米相結(jié)構(gòu)。即使在最低的PBI濃度下，醫(yī)院內(nèi)的金黃色葡萄球菌，大腸桿菌和銅綠假單胞菌的細(xì)菌細(xì)胞也會被殺死。洗滌水凝膠長達(dá)4周后，抗菌活性得以保留。使用一種新的定量檢測溶液中PBI的方法，IPH會顯示出PBI的少量浸出，遠(yuǎn)低于其抗菌活性濃度。該浸出不足以形成抑制區(qū)并殺死IPH周圍的細(xì)菌細(xì)胞。
這項(xiàng)工作的目的是制備具有最小含量的抗菌功能和可調(diào)節(jié)性能的接觸活性持久的抗菌水凝膠。實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的概念是制備互穿性水凝膠（IPH），該互穿性水凝膠由血液相容性，親水性抗菌聚陽離子PBI的高度膨脹的聚合物網(wǎng)絡(luò)組成，并由基于水凝膠的聚合物網(wǎng)絡(luò)互穿，從而形成丙烯酸2-羥乙酯（HEA）（示意圖1）。
示意圖1.抗菌IPH的制備
首先，通過交聯(lián)先前報(bào)道的聚合物PBI制備聚合物網(wǎng)絡(luò)。通過用各種雙鍵（例如苯乙烯，丙烯酸酯和肉桂酸酯）修飾聚合物，然后進(jìn)行紫外線輻射，可以實(shí)現(xiàn)紫羅烯的交聯(lián)。在該項(xiàng)工作中，決定對端基進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)，以實(shí)現(xiàn)最大程度的溶脹度，這是獲得最大可能吸水量所必需的。為此，通過反式1,4-二溴-2-丁烯（DBB）和N，N，N'，N'-四甲基-1,3-丙二胺（TMPDA）的加聚反應(yīng)制備了三種不同的聚合物，隨后 最后一步用DBB處理，以確保聚合物所有末端的溴基團(tuán)。使用1 H NMR，光散射（LS）和尺寸排阻色譜（SEC）對聚合物進(jìn)行表征，以確定分子量，分子量分布和端基修飾（表1）。
根據(jù)這些數(shù)據(jù)，所有聚合物均顯示出加聚反應(yīng)典型的分子量分布。 通過1 H NMR和SEC確定的Mn值的比較表明，后者值較高，因?yàn)? H NMR僅能高估分子量，原因是它涉及到溴端基。此外，所用的用于校正SEC的支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)品與色譜柱材料的相互作用可能較少，這將導(dǎo)致分子量被高估。1H NMR和LS分子量值更接近，表明大多數(shù)PBI端基確實(shí)被溴基修飾。因此，所有合成的PBI應(yīng)該是可交聯(lián)的。然后使聚合物與三（2-氨基乙基）胺（TREN）以不同的NH2/溴端基摩爾比反應(yīng)（參見表S1）。
表S1.同制備的PBIN的詳細(xì)組成及其計(jì)算的三種不同PBI的NH2 /溴（Br）端基的摩爾比。在所有情況下，使用的PBI儲備液的體積（40 wt％，ρ= 1.12 g/mL）均為500 μL。為了交聯(lián)，對于PBI5700和PBI7000使用5重量％的TREN溶液（ρ＝0.98g/mL），對于PBI3100使用10重量％的TREN溶液（δ＝0.98g/mL）。
理想情況下，當(dāng)以1：1的NH2/溴比例添加交聯(lián)劑TREN時(shí)，其效果最好，因?yàn)樗卸嘶伎梢苑磻?yīng)。然后，這將導(dǎo)致水中最低的溶脹度（S）。如圖1所示，S隨PBI分子量的增加而增加。1：1的比例沒有達(dá)到最小的溶脹，但是NH2基團(tuán)過多。
圖1. TBI交聯(lián)的PBI3100，PBI5700和PBI7000的PBI網(wǎng)絡(luò)在雙蒸餾水中的溶脹度（S）對NH2 /溴（Br）端基摩爾比的依賴性。網(wǎng)絡(luò)在室溫下膨脹2小時(shí)。
交聯(lián)實(shí)驗(yàn)還表明，NH2/溴的比率和PBI分子量的變化可用于控制溶脹度在20到170之間。這些網(wǎng)絡(luò)作為快速溶脹，抗菌劑非常有趣超級吸水劑。為了進(jìn)一步探索這種潛力，在交聯(lián)的PBI5700的實(shí)例上研究了切片PBIN以及通過切割干燥網(wǎng)絡(luò)制備的顆粒狀材料的吸水率。如圖2a所示，在室溫下僅需一分鐘即可完全吸收30倍于PBIN重量的水滴（NH2/溴端基的摩爾比為1.50）。在同一時(shí)間段內(nèi)，PBIN顆粒（NH2/溴端基的摩爾比為1.74）占其重量的48倍，形成水凝膠（圖2b）。這種凝膠仍可以在兩分鐘內(nèi)吸收相同量的水。PBIN在水中快速溶脹的原因可能是高電荷PBI的強(qiáng)親水性，這導(dǎo)致了理想的聚合物與水的相互作用。
圖2. a）和b）PBIN膜（NH2/溴端基的摩爾比為1.50）（a）和粒狀PBIN（NH2/溴端基的摩爾比為1.74）（b）在水里的快速溶脹照片。c）裝有4 mL生長培養(yǎng)基的15 mL獵鷹管的照片：（左）接種2.5×104S。金黃色葡萄球菌細(xì)胞/ mL并在37°C下孵育過夜，（中）在不添加細(xì)菌細(xì)胞的情況下在37°C孵育過夜，（右）6 mg PBIN（NH2/溴比1.50，用水洗滌五次）用10處理 將μL金黃色葡萄球菌在生長培養(yǎng)基中的懸浮液（107細(xì)胞/mL）放置10分鐘，添加到生長培養(yǎng)基中，并在37°C下孵育過夜。這些照片是在37°C孵育16小時(shí)并用TTC染色后拍攝的。
另外，聚合物網(wǎng)絡(luò)阻止了醫(yī)院內(nèi)細(xì)菌金黃色葡萄球菌（金黃色葡萄球菌）的生長。 通過用金黃色葡萄球菌懸浮液處理PBIN 10分鐘并將此水凝膠在細(xì)菌生長培養(yǎng)基中于37°C孵育過夜，可以證明這一點(diǎn)。在這段時(shí)間之后，沒有觀察到細(xì)菌生長（圖2c）。
選擇分別使用1.74（PBIN1.74）和1.50（PBIN1.50）的摩爾比制備的PBI5700網(wǎng)絡(luò)用于以下所有實(shí)驗(yàn)。通過在HEA（49 wt％），交聯(lián)劑（0.5 wt％），光引發(fā)劑（0.45 wt％）和水的混合物中將相應(yīng)的PBIN溶脹過夜，將互溶的PBIN進(jìn)行合成，從而完成互穿水凝膠（IPH）的合成并用紫外線輻射。在用紫外線輻射之前，終止每個PBI網(wǎng)絡(luò)的溶脹度（S）。由于混合物的復(fù)雜性，溶脹程度顯示出比水中更大的變化。確定所有準(zhǔn)備好的PBIN1.74（1）（S = 57-100）和PBIN1.50（1）（S = 25-36）的溶脹度。基于個體的溶脹度，計(jì)算最終干燥網(wǎng)絡(luò)中的PBI含量。所得互穿水凝膠分別命名為IPH1.50（1）和IPH1.74（1）。計(jì)算出IPH1.74（1）的PBI含量在2.0-3.5 wt％的范圍內(nèi)，而IPH1.50（1）的PBI含量在5.5-7.8 wt％的范圍內(nèi)。
產(chǎn)品是透明，有彈性和水溶脹性的材料。這表明兩個網(wǎng)絡(luò)（PHEA和IPH）在微米級別上沒有相位分離。為了除去所有副產(chǎn)物，在進(jìn)一步分析之前，將IPH在蒸餾水中洗滌7天，因?yàn)闊o法部分破壞PBI起始網(wǎng)絡(luò)，而無法對其進(jìn)行洗滌。發(fā)現(xiàn)凝膠含量為86-88％，表明有效的交聯(lián)。在IPH1.50（1）的示例中，通過掃描電子顯微鏡（SEM）結(jié)合能量色散X射線（EDX），透射電子顯微鏡（TEM）和原子力顯微鏡（AFM）研究了所得材料的結(jié)構(gòu)。其中應(yīng)包含從起始原料計(jì)算得出的7.8 wt％PBI（圖3）。如圖3a所示，與PBI結(jié)合的溴作為季銨鹽功能的抗衡離子很好地分布在基質(zhì)中。IPH截面的TEM和AFM顯示出這種網(wǎng)絡(luò)典型的獨(dú)特納米結(jié)構(gòu)。AFM中的暗相歸因于PBI。分離后一相并將其包埋在該組合物典型的滲透PHEA相中（8/92 wt/wt）。PBI相的大小約為3.6 nm。兩種方法均未觀察到較大的相分離。
圖3. a–c）在37°C下清洗7天后的IPH1.50（1）的掃描電子顯微鏡（SEM），透射電子顯微鏡（TEM），原子力顯微鏡（AFM，c）圖像 在水里。a）插入的方框標(biāo)出了一個典型區(qū)域，在該區(qū)域中累積了通過SEM-EDX分析標(biāo)準(zhǔn)元素的計(jì)數(shù)。d）該表顯示了在水中洗滌7天后通過SEM-EDX測定的IPH1.50（1）和IPH1.74（1）中的溴含量以及從這些值計(jì)算得出的IPH中相應(yīng)的PBI含量。e）分別處于干燥狀態(tài)的典型PHEA（1），IPH1.50（1）和IPH1.74 /（1）網(wǎng)絡(luò)的照片。
制備了一系列在PHEA相中具有不同交聯(lián)劑含量的系列，以研究網(wǎng)絡(luò)水溶脹的可控性。如圖4所示，IPH的可溶脹性受PHEA相中交聯(lián)劑的量控制。PBI含量較低的IPH1.74網(wǎng)絡(luò)與相應(yīng)的交聯(lián)PHEA膨脹程度相同。與PHEA網(wǎng)絡(luò)相比，IPH1.50中較高的PBI含量導(dǎo)致較高的溶脹，表明PBI相開始在該含量下影響水凝膠的性能。但是，對于IPH，未發(fā)現(xiàn)PBIN的高溶脹速率，而IPH需要24小時(shí)才能達(dá)到平衡溶脹。
圖4.經(jīng)過PHEA，IPH1.50和IPH1.74網(wǎng)絡(luò)（分別為1 wt％（灰色），3 wt％（灰色）或5 wt％（白色））的PHEA，IPH1.50和IPH1.74網(wǎng)絡(luò)72小時(shí)后，在雙蒸水中的溶脹度 相對于HEA的使用量，GDMA作為交聯(lián)劑。
通過使細(xì)菌細(xì)胞與PBS緩沖液中的表面接觸3小時(shí)來測試水凝膠的抗菌性能。然后通過超聲去除粘附的細(xì)胞，并在瓊脂平板上計(jì)數(shù)菌落形成單位（CFU）。將發(fā)現(xiàn)的CFU數(shù)量等于存活細(xì)菌細(xì)胞的數(shù)量，與在沒有PBI的相應(yīng)PHEA水凝膠上發(fā)現(xiàn)的CFU數(shù)量進(jìn)行比較。結(jié)果顯示兩種IPH的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的log 5減少（見圖5a）。如圖5b所示，已生長的細(xì)菌菌落到達(dá)水凝膠表面，但不在水凝膠上生長，即存在沒有可見的抑制區(qū)，表明抑菌劑有毒濃度的浸出。另外，將水凝膠IPH1.50（1）在生長培養(yǎng)基中孵育3小時(shí)，其量用于在37°C下測試抗菌活性（50 mg水凝膠/1 mL生長培養(yǎng)基）。
圖5. a）孵育后，經(jīng)過水洗的網(wǎng)絡(luò)IPH1.74（1）（在37°C時(shí)為12天）和IPH1.50（1）（在37°C時(shí)為27天）表面的細(xì)菌細(xì)胞減少 在PBS中3小時(shí)的時(shí)間。b）將金黃色葡萄球菌菌落噴灑在帶有嵌入式IPH1.50（1）網(wǎng)絡(luò)的瓊脂平板上（用水洗滌7天），在37°C孵育過夜并用TTC染色后形成的圖像。
參考文獻(xiàn)：
doi.org/10.1021/acsami.7b10049
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